Les extraterrestres ont atterri dans un Los Angeles futuriste et c'est au Duke de leur faire mordre la poussière et de les mettre à la porte. Après les premières entrées de jeux de plateforme à défilement horizontal, Duke Nukem 3D introduit une perspective à la première personne dans la série et transforme le jeu en un véritable jeu de tir avec des graphismes en 2.5D. L'arsenal de Duke comprend des pistolets, des bombes tuyaux, des mines laser à déclenchement, des mitrailleuses Nordenfelt, une mitrailleuse rotative et divers lance-roquettes, mais aussi son puissant pied pour donner des coups aux ennemis. Le jeu offre un haut niveau d'interactivité. De nombreux objets dans l'environnement peuvent être cassés ou manipulés, tels que les tables de billard, les machines d'arcade, le verre, les interrupteurs et les caméras de sécurité. Le protagoniste peut également donner des dollars à des strip-teaseuses pour qu'elles enlèvent leur haut.